鲨烯合酶(squalene synthase, SS)是生物体内胆固醇合成 、代谢途径中的一种重要的酶(Gu et al., 1998)。在药用植物的次生代谢中，SS 也是三萜皂苷和甾醇生物合成过程中的关键酶，SS 能够催化 2 分子的法尼基焦磷酸(farnesylpyrophosphate, FPP)合成 1 分子的鲨烯(squalene) (Busquets et al., 2008; Kim et al., 2011; Han et al., 2012)。目前已经克隆了包括人(Sum-mersa et al., 1993)、拟南芥(Busquets et al., 2008)、裂殖酵母(Robinson et al., 1993)等在内的众多物种的 SS 基因。通过转基因技术将 SS 转入柴胡(Bupleurum fal- catum)后，能够提高其三萜皂苷和植物甾醇的含量(Kim et al., 2011)，通过抑制人参(Panax ginseng) SS 的表达则可降低三萜类的积累量(Han et al., 2012)。

不同物种或是同一物种的不同基因其同义密码子使用是不均衡的，即密码子的使用具有偏性(杨春亮等, 2012)。而密码子偏性的存在，则可对基因的外源表达产生影响，造成外源基因的表达量低下甚至不表达(谢磊等, 2004; 赵武等, 2008)，如拟南芥中的 2 个不同构型的 SS 基因在大肠杆菌中进行体外表达，效率较低(Busquets et al., 2008)。根据宿主密码子的偏爱性对外源基因进行了优化，可以在不改变氨基酸序列的基础上提高目的蛋白的表达量，为研究蛋白的纯化和功能做出贡献(Zhou et al., 2012; 唐龙盘等, 2011; 张正平等, 2010)。通过优化第 2、5 和 6 位密码子的 4 个碱基能够明显的提高甘油脱氢酶基因 (glycerol dehydrogenase) 在大肠杆菌中的表达水平(唐龙盘等, 2011)。通过定点突变α-糖基转移酶基因(α-cyclodextrin  glycosyltransferase)，α- 糖基转移酶产量达到了最高值的 48.9 U/mL (Zhou et al., 2012)。 因此，密码子优化是改善目的基因异源表达水平的一种有效方法。本文通过对 SS 的密码子使用偏性进行分析，构建系统进化树，为下一步开展体外高效表达 SS 蛋白，研究 SS 的生物功能以及调节植物等的次生代谢等提供理论参考。

1结果与分析

1.1各物种SS 基因的 GC 含量和 ENC 值

SS 基因密码子各位置的 GC 含量、编码氨基酸 有效密码子数(effective number of codons, ENC)和密 码子数目的相关关系如表1所示。SS 基因的总体 GC 含量为 46.78%，GC1、GC2 和 GC3 分别为 51.33%、 34.65%和 54.37%。整个编码区的 GC 含量与 GC1、 GC2、GC3 之间的相关性均达到了极显著水平(p＜0.01)。GC1、GC2 与 GC3 之间相关性达到极显著水 平(p＜0.01)，且表现为 GC3＞GC1＞GC2，说明 SS 基因密码子的第 1、2、3 位碱基的组成较相似(r 分别为 0.626, 0.853 和 0.555)，不存在显著差异(表2)。由表2中 GC 与 GC1、GC2 和 GC3 之间的相关系数(r 分别为 0.912, 0.656 和 0.987)可知 GC 与 GC1、GC2 之间的相关性更强。ENC 的最小值为 32.30，最大值为 61，均值为 51.03，ENC 值均比较大，密码子存在偏性但不明显，且 ENC 值和密码子第 1、2 和 3 位的碱基的相关性未达到显著水平(表2)。

1.2各物种 SS 基因密码子的偏性

1.2.1 ENC 和 GC3 的相关性分析

以 47 个物种 SS 的GC3 值和 ENC 值分别为横、纵坐标绘图(图1)。由图可知，SS 沿期望值曲线分布或落在期望值曲线的下方，但大多数距离期望值曲线较近，只有少数远离期望值曲线。大多数的 SS 基因偏性较弱，少数基因偏性较强。说明 SS 的密码子偏性形成受突变和选择的共同作用，其中碱基突变的影响更强烈。

1.2.2各物种 GC12 和 GC3 的关系

各物种 SS 基因的中性绘图分析结果如图2所 示，多数 SS 基因主要分布于对角线下方。GC3 的分布范围在 0.131 4~0.817 4 之间，GC12 的分布范围在0.358 4~0.506 5 之间，GC12 分布较为紧凑。GC3 分布范围较大，主要是由于白色念珠菌(Candida  albi- cans)的 GC3 值(GC3 为 0.131 4, GC12 为 0.366 4)偏小引起的。GC12 与 GC3 的相关性双尾检验达到极显著水平(p ＜0.01)，回归曲线斜率为 0.149 7，说 明 GC12 与 GC3 的相关性很强，密码子 3 个位置的碱基组成无差异，密码子的偏好受突变的影响，选择在密码子偏性形成过程中作用较弱，突变在此过程中的作用较强。

1.3对应性分析

以同义密码子相对使用频率( relative synony- mous codon usage, RSCU)为基础，进行对应性分析，第 1 轴显示了 30.71%的差异，第 2、3、4 轴分别显示 了 13.52%、10.80%和 9.40%的差异。前 4 轴差异合计 64.43%，以第 1 轴为主，其余各轴差异不明显。第 1 轴与 GC3 双尾检验达到极显著水平(p<0.01)，呈极显著正相关关系(r=0.989)。第1轴与密码子适应指数(codon adaptation index, CAI) 和密码子偏好指数(codon bias index, CBI)的相关性达到双尾侧检验极显著水平(p<0.01, r 分别为 0.758 和 0.766)。说明GC3 对 SS 基因密码子的偏性有较大的影响，同时物种差别等其它因素对 SS 基因密码子的偏性也有一定影响，其使用模式形成过程较为复杂。

根据各物种的进化水平，将 SS 基因分为：微生物类的 SS 基因(编号 1~20, 共 20 条)、动物类的 SS基因(编号 21~26, 共 6 条)和植物类的 SS 基因(编号 27~47, 共 21 条)。以第 1 轴为横坐标，第 2 轴为纵坐标将各物种 SS 基因分布于平面中。除了动物中的 Naegleria gruberi 的 SS 基因，微生物中的白色念珠菌和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的 SS 基因相对分散度较大外，其它的动物、植物和微生物的 SS 基因则集中分布(图3)。这说明动物、植物、微生物类 的各物种 SS 基因的碱基构成更为相似，SS 基因各自分布更为集中。

1.4最优密码子分析

通过比较 47 条不同物种的 SS 基因，根据其 ENC 值的大小，筛选高、低表达基因，高表达基因的 ENC 均值为 49.59，低表达基因的 ENC 均值为 46.82，分别计算高表达和低表达基因中各密码子的 RSCU 值， 确定 了 SS 基因中存在除了 AUG、 GUG、UAG、UGG、AGG、GGG 以外的 26 个以 G/C 为第 3 位的密码子为最优密码子。SS 基因最优密码子使用频率(frequency of optimal codons index, FOP) 的范围为 0.31~0.54 之间 ，均值为 0.41，最优密码子的使用频率较高。SS 基因偏好使用 G/C 结尾的密码子。

1.5基于 SS 基因密码子偏性的聚类分析

在对基因密码子使用频率进行聚类分析的过程中，将每一条基因作为一个对象，将密码子的 RSCU 值作为变量，利用 SPSS 16.0 进行聚类分析，聚类结果见图4A。由 MEGA 5.0 的 neighbor-joining 连接法构建的 47 条 SS 蛋白的系统发育树如图4B 所示，20 种微生物首先聚为一支，动植物和原虫的亲缘关系较近聚为一支，随后和微生物聚为一个大的分支。通过比较系统发育树的结果可知，在 2 种不同方法构建的系统发育树中，动物物种的 5 条 SS 基因都聚为 一支，且聚类结果相同；植物类和微生物类物种的 SS 基因大体上聚类结果一致。但是基于 RSCU 的聚类结果显示，微生物类物种中的 Ajellomyces capsulatus 和 A. dermatitidis 的 SS 基因和植物类玉米聚为一 类，而基于氨基酸序列的聚类结果则显示，上述 2 个物种与其它微生物类物种聚为一个大类，随后和动植物聚为一类。另外，在依据 RSCU 进行的聚类分析中，N. gruberi 和白色念珠菌聚为一类，和其它的物种距离均较远，而在基于氨基酸序列的进化树中则和植物聚为一类。

2 讨论

大肠杆菌中的稀有密码子包括 AGA、AGC、 AUA、CCG、CCU、CUC、CGA 和 GUC，共 8 个(Gros- jean and Fiers, 1982)，若外源基因中包含这些稀有密码子时，会显著降低其表达效率(谢磊等, 2004)。SS 基因的所有密码子中 ，RSCU >1.0 的 CUC、GUC、 CCU、CGA、AGC、AGA (RSCU  分 别 为 1.35,  1.17, 1.08, 1.01, 1.04 和 1.29)，这些密码子属于大肠杆菌表达系统的稀有密码子，因此利用大肠杆菌作为受体进行原核外源表达 SS 基因时，应将其优化为大肠杆菌的常用密码子，以提高外源基因的表达量。在以酵母为受体菌，进行真核外源表达 SS 基因时，同样应该根据酵母的密码子使用频率分布信息(http: //www.kazusa.or.jp/codon)，对外源基因的对应密码子进行优化才能获得良好的体外表达。这种改造外源基因的密码子以消除其存在的宿主中的稀有密码子，而提高表达效率的研究，已在其它基因中被证实。如通过定点突变扩展青霉(Penicillum expansum) 脂肪酶基因中毕赤酵母的稀有密码子后，目的蛋白的表达量比野生基因重组子提高了2.3~2.5 倍(张正平等, 2010)。因此，根据对 SS 基因密码子偏性分析的结果，结合宿主密码子偏性的特点进行优化后，对提高 SS 基因的外源表达效率也同样适用。

生物体内密码子偏性的存在是选择、突变和遗传漂变相互平衡的结果(Bulmer, 1987; 晁岳恩等, 2011)。密码子的使用并不是随机的，不同基因的密码子使用偏性存在不同的特点(Guo et al., 2012)。偏爱使用以 A 或 T 碱基结尾的密码子的基因有双子叶植物 waxy 基因(刘汉梅等, 2010)，重要的抗寒调控转录因子 ICE1 (时慧等, 2012)等。偏爱使用以 G 或 C 碱基结尾的密码子的有单子叶植物的 waxy 基因(刘汉梅等, 2010)和大豆光周期抑制开花的重要抑制因子 RAV (related to ABI3/VP1) (杨春亮等, 2012)。SS 基因密码子分析结果显示了 SS 基因偏好于使用以 G 或 C 碱基结尾的密码子，与上述的 waxy 和 RAV 基因的密码子偏性较为相似。SS 基因在突变、选择等各种因素的作用下，产生了密码子偏性，其中突变的作用比选择的作用更强，这符合单基因密码子偏性形成的原因，多数是突变作用大于选择作用的特点(刘汉梅等, 2010)。

以不同物种 SS 基因的 RSCU 为基础构建的系统进化树和基于 SS 蛋白差异构建的系统发育树分 析结果的总体趋势一致，但不完全相同。这种基于 RSCU 与蛋白序列不完全相同的现象在其它研究中也出现过(时慧等, 2012; 晁岳恩等, 2011)。造成聚类 分析结果有偏差的原因可能是由于单个基因在物种中的突变，使密码子偏性出现大的不同，通过增加分析的基因类型和聚类时使用更多的指标，来弥补分析单一因素聚类的不足。基于 RSCU 的聚类分析可以作为传统的进化树建树的参考。

鲨烯合酶在初级代谢和次级代谢中均扮演着重要的角色。其催化合成的三萜皂苷类往往是有生理、药理活性的物质。本研究通过对 SS 基因密码子偏性进行分析，明确了不同物种中 SS 密码子使用的共同特点，为 SS 基因进行密码子优化，规避使用宿主稀有密码子和提高体外表达的效率提供借鉴。

3 材料和方法

3.1目的基因的获取和软件

本研究所采用的各物种 SS 基因的全长编码区序列(coding DNA sequence, CDS)信息均来自 GenBank。参照文献(时慧等, 2012)进行密码子分析时采用的 CDS 筛选原则，筛选符合条件的 SS 基因。根据该标准，共获得了 47 条来自不同物种的 SS 基因作为本研究的分析样本(表3)。

使用在线分析软件 codon W（http://mobyle.pas teur.fr/cgi-bin/portal.py?#forms::codonw)和 CUSP(http:// mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?#forms::cusp)，统 计 GC1、GC2、GC3 和 GC 值等指标，同时统计 CAI、 RSCU、ENC、CBI 和 FOP 等值。

3.2同义密码子偏性分析

通过 codon W 1.4.4 在线软件计算样本的总体 GC 含量，记为 GC。同时利用该软件计算 RSCU、ENC、CAI、CBI 和 FOP，并进行对应性分析。利用 CUSP 软件分别计算密码子第 1、2 和 3 位碱基的 GC 含量，分别记作 GC1、GC2、GC3。使用 SPSS 16.0 软件分析各变量之间的相关性。

ENC 值是目前公认在评价基因整体密码子偏性 用法中最具有参考价值的参数，该值用于衡量某条 基因或某个物种的密码子偏好程度，其取值为 20~61，密码子偏性越大，该值越小，反之亦然(时慧等, 2012)。GC 测量的是基因中 G 和 C 的含量。GC3 则计算密码子第三个碱基中出现 G 或 C 的频率。

3.3 ENC 与 GC3 的相关性分析

利用 ENC 和 GC3 值构建散点图。同时构建标准曲线，即密码子偏性仅由碱基组成决定时的基因 预 期 值 ，计算公式为：ENC = 2 + GC3 + 29/ [ GC32 + (1-GC3)2]。ENC 和 GC3 的相关关系可以用来分析密码子的使用受到突变和选择影响的幅度。当某基因的密码子偏性仅受突变影响时则分布于曲线附近，若其受选择影响较大则分布于曲线下方较远的位置(尚明照等, 2011)。

3.4中性绘图分析

将各物种 SS 基因的 GC12 (GC1 和 GC2 的平均值)作为纵坐标，GC3 作为横坐标进行绘图，分析 SS 基因密码子的 3 个位点碱基组成之间的相关性， 确定影响密码子偏性的因素。如果 GC3 与 GC12 相关性显著，说明 3 个位点的碱基组成相同，碱基突变在密码子偏性的形成中影响较大。否则，基因组 GC 含量高度保守，密码子不同位点的碱基组成不同，密码子的偏好特点受选择的影响较大。

3.5最优密码子分析

将 SS 基因中具最高和最低 ENC 值的各 10% 样本分别作为高、低表达组。计算高、低表达组的RSCU 差值，两者间的 RSCU 差值>0.08 的密码子确定为高 表达最优密码子(尚明照等, 2011)。 

3.6各物种 SS 基因的聚类分析

利用 SPSS 16.0 软件分析各条 SS 基因的 RSCU 值，进行基于密码子使用偏性的聚类分析。以密码子 为分组，采用 59 个密码子(去除编码蛋氨酸的密码子 AUG 和编码色氨酸的密码子 UGG 以及 3 个终止密 码子 UAA, UAG, UGA)的 RSCU 值。将各条 SS 基因 的 RSCU 值构建数据库，对密码子使用概率分析时， 将每一条基因作为一个对象，RSCU 作为变量，利用 各密码子 RSCU 值的欧式距离平方测定组间距离， 把最接近的 2 类合并为一个新类，最后分为 n-1 类， 输出树状结构图。

使用 MEGA 5.0 软件，采用 neighbor-joining 连 接法，构建 47 条 SS 基因编码蛋白质的氨基酸序列 的系统进化树。

作者贡献